Als erstes Innenministerium der neuen Länder stellte das Thüringer Innenministerium im Herbst 1990 die Weichen für ein eigenes LKA, in dessen Folge im Februar 1991 die Arbeitsgruppe "Aufbaustab Thüringer Landeskriminalamt" mit Beamten aus Bayern, Hessen, Rheinland-Pfalz und Thüringen eingesetzt wurde. Innerhalb von fünf Monaten wurden durch die Arbeitsgruppe präzise Vorstellungen zur Struktur, zum Personal und zur Geschäftsverteilung unterbreitet sowie ein Stufenplan zum Aufbau dieser neu zu gründenden Behörde entwickelt. Am 01. Juli 1991 nahm das Landeskriminalamt - als zentrale Dienststelle für kriminalpolizeiliche Aufgaben - seine Arbeit auf. Die folgenden drei Jahre waren davon geprägt, die Organisationsstruktur inhaltlich zu festigen und die haushaltsmäßigen Voraussetzungen für zentrale Spezialbereiche, wie z.B. Informations- und Kommunikation und Kriminaltechnik zu schaffen.

Von 1992 bis 1995 wurde das Gebäude des TLKA im laufenden Betrieb umgebaut und modernisiert. Nach dem Regierungswechsel 1994 wurde eine Überprüfung der Polizeiorganisation veranlasst, die unter anderem eine Stärkung der Zuständigkeiten des Landeskriminalamtes im operativen Bereich anstrebte. Dem Landeskriminalamt wurde daraufhin das Spezialeinsatzkommando (SEK) organisatorisch angegliedert und darüber hinaus die Bekämpfung der qualifizierten Wirtschaftsstraftaten zugewiesen. In den folgenden Jahren wurden wiederholt Strukturoptimierungsvorschläge bzw. -veränderungen beraten und umgesetzt. Bestehende Schnittstellen und Doppelgleisigkeiten wurden abgebaut und reduziert. Ende Februar 2001 wurde das Landeskriminalamt beauftragt, unverzüglich eine Abteilung "Polizeilicher Staatsschutz" zu errichten. Heute verfügt das LKA über sechs Abteilungen mit insgesamt 22 Dezernaten.